Saal Püha Roodi palees. Tema sõnul on linnas rahutused. Keegi võõras, kes talle rahva eesotsas oli - emmed, maskid, kellukestega tantsijad, mustas kapuutsiga inimesed -, ähvardasid, ennustasid ja kutsusid inimesi üles kuningannale mitte kuuletuma. Kuninganna Riccio õukond kinnitab, et ta jälgib aeg-ajalt ka seda, kuidas inimesed neid jutlusi innukalt kuulavad. Leht räägib veel, et inimesed purskasid kuninganna kabelisse hüüdes: “Pappistide pesa!”, Et kuninganna abikaasa Darnley puhvetis hüppas altari ette ja hakkas teesklema jutlust ning inimesed vastasid talle pilkavate kupeetega. Kuninganna Mary Stuart meeleheites. Ta tunneb inimeste vaenu; enamik kohtunikke on ta maha jätnud; ta imestab, kuidas tema kristlus võib olla nii erinev Šotimaa inimeste kristlusest. Riccio teeb ettepaneku viivitamatult koostada määrus, millega karistatakse massirahutuste eest vastutajaid. Maria dikteerib oma lehe, leht selgitab, kas sisestada kuninganna abikaasa Heinrich Darnley nimi. Maarja kõhkleb; ta kahtlustab, et rahutused olid temast inspireeritud - juhib rahva juuresolek kuninga puhvetit. Riccio tuletab talle meelde, et ta on kuninganna; ta on nagu päike ja tal on õigus Jumalalt karistada. Ta nõuab, et kutsuks viivitamatult valveametniku üles kuninganna dekreedi teatavaks tegema. Douglas siseneb. Maria käsib tal viia paber kuninglikule kantslerile Mortonile, et ta tembeldaks. Douglas skaneerib dekreedi ja näeb, et sellel pole kuninga nime. Ta küsib selle kohta kuningannalt. Riccio vastutab tema eest. Douglas kaotab karastuse. Ta kutsub kuningannat üles mitte kasutama veriseid tõrjemeetmeid, vihjates, et ta peab seda prantsuse või itaalia mõjutamiseks. Kuid kuninganna tuletab talle külmalt meelde tema võimet kõrvaldada tema tahtele allumatud subjektid. Riccio ja Douglase vahel puhkeb tüli, Douglas kutsub Riccio duellile ja vannub, et tapab homme Veneetsia. Kuninganna lahkub ja viib Riccio minema. Douglas jäetakse üksi, ta kaalub duelli. Morton siseneb. Douglas näitab talle dekreeti. Morton on otsustusvõimetu: ta kardab nii kuninga kui ka kuninganna viha. Ilma tembeldamiseta teeb Morton kuningale pakkumise. Sel ajal pidas Henry vestlust oma jester Nickiga, kes kiusas teda sellega, et kuningannal on Šotimaal tõeline võim ja Henry on ainult tema abikaasa, et kuninganna valib lähedased, näiteks see itaalia harfist Riccio ... Sel ajal on Morton toob kahetsusväärse dekreedi. Kuningas vihaselt otsustab Riccio tappa. Kuningas Lindsay astub platsile, ta kutsub kuninga jahtima koos äsja omandatud pistrikuga. Morton vastab, et kuningal on juba täna okupatsioon. Lindsay liitub Riccio vastu meelega. Ta keelab sõna otseses mõttes Riccio tapmise täna õhtul, sest ta peab ta homme hommikul tapma. Seejärel saadab Henry, kasutades ära viivitust, jesteri astroloogi juurde, et teada saada, milline on tähtede asukoht tema kavatsuste jaoks.
Astroloog oma laboris (ta on ka alkeemik) väidab endaga, et kogemus kinnitab teaduse mõttetust, sel eesmärgil domineerib tähtede tahe inimeses, käsutab head ja kurja. Nick tuleb sisse, piserdab vittismiga, astroloog pole temast vaimukuses halvem. Nick teatas, et kuningas saatis ta Riccio saatuse kohta küsima ja käsib astroloogil ennustada Riccio surma. Astroloog vastab, et tähed ütlevad talle, mitte inimestele, ja ennustab omakorda jesteri surma. Sellega ta lahkub. Ilmub astroloogi põhjustatud kuninganna leht. Page armastab oma armukest. Astroloog palub tal öelda kuningannale, et täna sureb mees, keda ta armastab. "Kuidas Botwell täna sureb?" - hüüatab leht. Astroloog on hämmingus. Ta pidas Riccio meeles ja kiirustab lehte, et teda selle eest hoiatada. Üksinda üksi astroloog imestab - ka tähtede alt selgus, et Botwell oli kuningannaga kuidagi tumedalt seotud - läbi Marsi, Saturni ... Botwell siseneb. Tema monoloogi põhjal saab selgeks, et ta sattus ootamatult astroloogi majja. Mõistes, kuhu ta sattus, küsib Botwell astroloogilt, kui palju on tal elada jäänud. Vanamees vastab, et kolm aastat ja et Botwell saab kuningaks. Botwell võtab välja pudeli mürki, millega ta tahtis enesetapu teha, tahab selle ära visata - ja kõhkleb. Palee intriigide õhkkonnas on tõepoolest iga relv kasulik. Ta lahkub.
Leht teatab kuningannale, et Riccio tuleb varsti. Kuninganna ootab teda väga - tema arvates jäi ta üksi talle truuks. "Ja Botvel?" Leht küsib. "Kes on Botvel?" - on kuninganna huvitatud. Üllatunud leht räägib Maarjale, kuidas paadis olles tugev tuul kuninganna peast roosi tõmbas, lill kukkus vette. Ja siis tormas üks õukondadest - Botvel - paati ja jälitas hirmsasti sõudjat, et veest roosi püüda. Pärast loo kuulmist saadab Mary lehe palvetamiseks. Ta tunnistab jumalale, et tal pole enam jõudu vastu seista oma armastusele Botwelli vastu. Kuninganna teab, et kohtus peetakse teda Riccio armunuks. Riccio siseneb. Maarja teatab surelikust ohust, mis teda ähvardab, ja jätab temaga külmalt hüvasti, osutades laevale, mis viib ta Rooma. Meeleheites üritab Riccio kuningannat lahkumisotsuse tühistamiseks paluda. Kuninganna on kindel.
Heinrich, Morton ja Lindsay said teada Riccio eelseisvast lahkumisest ja andsid kiiruga loa tappa ta või lasta tal purjetada. Siis ilmub Douglas ja teatab, et Riccio on juba purjetanud. Douglas meeleheites, igatseb verist kättemaksu, rüütli au on talle haiget saanud. Järsku kohtavad nad lehte, mis toob kuningannale Riccio noodi - ta ei lahkunud ja on õhtul temaga. Vandenõulased võtavad noodi ära.
Maria tikib oma toas usinalt. Tulnud Riccio selgitab naisele, et ta ei saanud lahkuda, sest tal on hommikul Douglasega duell. Ta tunnistab, et ta ei vaja elu ilma tema armastuseta. Ta palub Maarial anda talle rooside pärja - Roomas istutab ta altarile lilli ... Henry, Douglas ja Dindsay tulevad sisse ja tapavad Riccio. Kuninganna minestab. Douglast tabab häbi ja õudus - ta läheb vabatahtlikult pagulusse. Henry on mures, kas kuninganna vihkab teda. Lindsay viib kuninga ära, sosistades talle eelseisvast jahist. Kuninganna on kutsunud kuninganna Botwelli. Maarja tuleb meelde, näeb Botveli ja tunnistab talle oma armastust. Botvel sunnib teda tunnistama, et tahab Henry surma ja annab talle oma mürgipudelit, öeldes, et see on unerohi. Maarja annab “ravimi” kuningale edasi, kuid mürk joob pühvlit. Kuid miski ei suuda mõrvarlikku intriiki peatada - Botwell õhkab kuningas Henry maja. Eemalt kuuleb rahvahulga kasvavat nutmist. Botvel kuningannaga on peidus.